Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ця робота описує виготовлення інженерних трубчастих колагенових основі конструкцій, що містять судинні клітини. Вже після 1 години від початку желатинизации, клітини-і-колагену суміш безпосередньо зібрані в 3D геометрії трубчастого, з зовнішнім діаметром, рівним діаметру відповідної форми (близько 14 мм). Всі разом статичного дозрівання, вимірювання показали швидке зменшення зовнішнього діаметра трубчастих структур cellularized, як показано в таблиці 1. Діаметр cellularized гелів колагену скоротилася приблизно на 60% від свого початкового значення після 1 дня статичної культури, і майже 85% протягом 7 днів (Довідкова відео 2). ГМК усередині конструкцій несуть відповідальність за спостерігається скорочення і відповідної механічної арматури, як це явище не відбувається в не-cellularized колагенових каркасів. Слід зазначити, що ні градієнт будь-якого типу (теплової, біохімічних, механічних або інших) не застосовується. Клітини-діскп пресування в результаті матеріалу з більшою щільністю колагену, які можуть бути оброблені і пригніченого до механічних клопотання (додатковий відео 3 і 4).

Щоб зв'язати клітини-приводом ремоделювання в загальному механічних і в'язкопружних властивостей, втомні випробування проводилися на конструкціях (Додаткові Відео 5 і 6). Ці випробування полягала в велосипеді конструкти (в 30 разів) при різних постійних деформацій (10%, 20% і 30% від вихідної довжини датчика) і записати напругу як відгук конструкцій до механічних клопотання протягом довгого часу. Представницькі результати однієї конструкції показані на малюнку 9. Конструкція витримали високі напруги в поздовжньому напрямку (75 кПа), ніж в окружному напрямку (16 кПа) при впливі на тому ж діапазоні деформацій (30% деформації). Тим часом, в кожному циклі, пікова напруга досягла значення для ТАrgeted максимальна напруга з часом зменшується. Така поведінка характерна для високих вязкоупругих властивостей, які проявляються цими основі колагену конструкцій.

Біологічна активність cellularized конструкцій оцінювалася в ході статичного дозрівання. Отже, метаболічна активність ГМК оцінювали шляхом вимірювання споживання глюкози і лактату при статичному культури. Культуральне середовище відбирали кожні 2 дні і глюкози і лактату концентрації були виміряні з використанням газоаналізатора крові. Постійне збільшення споживання глюкози і лактату в поєднанні з важливою скороченням конструкцій, свідчать діяльності ГМК все разом статичного культури (рис 10).

Збільшення механічної міцності через клітин приводом ремоделювання дозволено маніпулювання конструкцій і подальший процес ендотелізаціі. Фарбування тріхромом Массона виконані на endothelialized конструкційпоказалі вельми однорідну ендотелій. ГМК виставлені шпинделя-подібний, як морфологія і з'явилися рівномірно розсіяні по стіні, в той час як HUVECs з'явилися також поширюватися в просвіті боку (рисунок 11).

Малюнок 1:. Компоненти статичного біореакторі статичного біореактор складається з модифікованого 50 мл центрифужную пробірку (А) і оправлення, обладнаний кришкою (B). Трубка служив середнього резервуара, і був обладнаний портом для 0,22 мкм фільтр, для газообміну, і перегородку, для середнього вибірки і зміни. Оправлення присутній в провітрюваному кришкою дозволяється виготовлення конструкцій в трубчастої форми. Марлю-захоплення (C) були розроблені і виготовлені, щоб підтримати ГЕЛЕУТВОРЕННЯ конструкцій по оправці. Крім того, етізахвати дозволили конструкції повинні бути оброблені після статичного дозрівання і бути прикріплені до механічним пристроєм. Зовнішній діаметр оправки 4,7 мм.

Малюнок 2: Збірка статичної біореакторі Збірка фази біореактора до стерилізації .. Марлю-захоплення змонтовані на оправці (A) на фіксованій відстані. Форму вставити (В) і щільно прикріплена до силіконової пробкою (C). Зовнішній діаметр оправки 4,7 мм.

Малюнок 3 :. Виготовлення конструкцій в стерильних умовах клітини і колаген суміш виливають в корпус-форми комплексу (А), і нехай гель протягом 1 години при кімнатній температурі (B). Після цього прес-форму молодецький ють (С), статичну біореактор був зібраний (D) і переносили в резервуар для дозрівання статичного конструкту в інкубаторі (Т = 37 ° С, 5% СО2, 100% вологості). Зовнішній діаметр оправки 4,7 мм.

Малюнок 4 :. Вимірювання товщини / зовнішній діаметр конструкцій лазерного сканування інтерферометра для виконання вимірювання зовнішніх діаметрів конструкцій. Конструкція була поміщена в шляху лазерного променя і генерується тінь. Ширина тіні, відповідний зовнішньому діаметру конструкції, потім вимірюється і відображається на екрані.

e_content "FO: тримати-together.within-сторінку =" завжди ">
Малюнок 5 :. Морфологічні зовнішній вигляд зібраного конструкції (А) Відразу після гелеобразования і (б) після клітини орієнтованого на ремоделирование при статичному дозрівання протягом 2 тижнів.

Малюнок 6: Експериментальна установка для механічних характеристик Він складається з мікромеханічного тестера, забезпечений датчиком навантаження 5 або 10 Н і ванну, що містить PBS при 37 ° С, щоб зберегти зразки в псевдо-фізіологічних умовах ..

Малюнок 7: Підготовка зразків F або механічні характеризації. Зразок прибирання () і підготовка (B) для втомних випробувань, проведених в поздовжньому і окружному напрямках (С). Зовнішній діаметр оправки 4,7 мм.

Малюнок 8: Поворот стінки біореактор (А) Трубчасті конструкції були зібрані в центрі резервуара за допомогою С-образного силіконового підтримки .. Обидва кінцівок конструкції були закриті, щоб уникнути будь-якої витоку розчину HUVECs. (Б) Конструкції культивували в інкубаторі (Т = 37 ° С, 5% СО2, 100% вологості) в обертання при 4,02 х 10 -5 г силу в протягом 2 днів.

2 / 52812fig9highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Малюнок 9: .. Механічні характеризації Результати втомних випробувань, виконаних на конструктів в поздовжньому (A) і окружних (B) напрямках після клітинної приводом ремоделювання Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 10 :. Метаболічна активність ГМК в рамках гелів колагену Вимірювання глюкози швидкості споживання і лактату дебіту були виконані з аналізатором газів крові кожні 2 дні, після зміни живильного середовища. Свіжої культуральної середовищем був використаний в якості вихідного рівня для вимірювання глюкози і лактату концентраціях.

Малюнок 11: Люмен ендотелізаціі

гістологічні зображення радіальних перетинів трубчастих конструкцій .. Массона трихома фарбування трубчастих конструкцій культивували статично протягом 1 тижня (а) і 2 тижні (B). Н & Е фарбування трубчастої конструкції (С). Час Товщина (мм) Ущільнення (%) 0 год 4.83 ± 0.02 0 ± 0 2 ч 4.26 ± 0.02 12 ± 0 4 ч 4.21 ± 0.03 13 ± 1 6 год 4.06 ± 0.10 16 ± 2 12 чR 3.16 ± 0.07 35 ± 1 + 1 день 2.08 ± 0.11 57 ± 2 1 тиждень 0.68 ± 0.07 86 ± 1 2 тижні 0.36 ± 0.00 93 ± 0

Таблиця 1: Швидке ущільнення діаметром конструкту протягом статичного дозрівання товщина стінки конструкцій і швидкість ущільнення як функцію часу статичної культури .. Ущільнення вимірювали шляхом визначення зовнішнього діаметра трубчастих конструкцій за допомогою скануючого лазерного інтерферометра (серії 183b, LaserMike 136). Через 24 години, конструкції ущільнений до 57% ± 2% від їх розмірів формуваннях. Які Дані висловлювали у вигляді середнє ± стандартне відхилення (n = 3). Наявність і активність живих клітин гладких м'язів було тільки за такими великими змінами.

Су pplemental Відео 1 :. Заготівля, які не є-відремонтований гелів трубчаста колагенових Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися це відео.

Довідкова Відео 2 :. Клітини-приводом для ущільнення трубних гелів колагену Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися це відео.

Довідкова Відео 3 :. Маніпуляції з не-відремонтований гелів трубчаста колагенових Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися це відео.

Довідкова Відео 4 :. Маніпуляція клітин-відремонтований трубчаста колагенових гелів Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися тис це відео.

Довідкова Відео 5 :. Поздовжня втома тест (на 30%) на клітини-відремонтований трубчаста колагенових гелів Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися це відео.

Довідкова Відео 6 :. Окружна втома тест (на 30%) на клітини-відремонтований трубчаста колагенових гелів Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися це відео.