Як роблять допінг-контроль + список заборонених препаратів

1. Розкажіть друзям:

Про те, яка непроста задача стоїть перед хіміками-аналітиками під час спортивних змагань, розповідає заступник директора, завідувач лабораторією хромато-мас-спектрометричних методів аналізу ФГУП «Антидопінговий центр», кандидат хімічних наук Тимофій Геннадійович Соболевський.

У світі робиться величезна кількість антидопінгових проб, причому не тільки під час змагань, але і між ними. Які проби беруть у спортсменів і з якими проблемами стикаються при цьому хіміки?

Наш ФГУП «Антидопінговий центр» аналізує близько 15 000 проб сечі і близько 4000 проб крові в рік. Більшу частину речовин зі списку заборонених препаратів визначають саме в пробах сечі. Втім, за останні десять років все частіше беруть і аналіз крові, оскільки тільки так можна перевірити, чи робили спортсмену переливання крові, а також визначити рівень гемоглобіну, гематокрит, концентрацію еритроцитів і інші параметри, які передбачає програма «Біологічний паспорт спортсмена».

Гормон росту, деякі види еритропоетину і інсулінів також визначають виключно в сироватці крові. Сьогодні деякі антидопінгові лабораторії проводять дослідження, мета яких - продемонструвати, що аналіз крові може бути вичерпним і по ньому можна визначити всі. Але оскільки кров все-таки відбирати складніше (для відбору потрібен фахівець з медичною освітою), та й багато методики доведеться розробляти заново, напевно і в подальшому антидопінговий контроль буде головним чином заснований на аналізі проб сечі.

Проблем у хіміків, що працюють в області допінг-контролю, досить багато. За останні десять років список заборонених препаратів істотно розширився, з'явилися нові заборонені класи сполук, для визначення яких довелося розробляти і впроваджувати методики аналізу. Зрозуміло, що це вимагає грошей і виключно високої кваліфікації персоналу лабораторій.

Взагалі система працює таким чином:

Є антидопінгові лабораторії, які аналізують що надходять до них проби, а є національні і міжнародні антидопінгові організації, які планують і відбирають ці проби у спортсменів, причому як під час, так і поза змаганнями. Щоб інспектори допінг-контролю могли в будь-який момент взяти пробу, спортсмени міжнародного рівня на кілька місяців вперед надають інформацію про своє місцезнаходження (на кожен день!). Список речовин, заборонених поза змаганнями, майже вполовину менше, але в цілому допінг-контроль відбувається майже безперервно. Результат аналізу лабораторії відправляють в антидопінгові організації, які роблять відповідні висновки і розслідують порушення. Лабораторія лише виявляє присутність (або відсутність) в пробах спортсменів заборонених субстанцій і зворотного зв'язку зі спортсменами не має.

Як вдається визначити таку велику кількість найрізноманітніших речовин? І які нові методи для цього пропонують хіміки?

Це дійсно нелегко. Років десять тому, коли список заборонених засобів був приблизно в два рази коротше, більшість антидопінгових лабораторій дотримувалися практики: кожному класу речовин - окрема лінія аналізу. Іншими словами, окремо визначали летючі стимулятори, наркотики, анаболічні стероїди, діуретики, бета-блокатори, кортикостероїди ... Через великої кількості ліній аналізу було неможливо швидко досліджувати багато зразків. Щоб «спіймати» невеликі концентрації речовин, проби доводилося концентрувати. В основному лабораторії поєднували газову хроматографію з мас-спектрометрією. Для визначення речовин в наноколічествах використовували мас-спектрометри з високою роздільною здатністю (магнітні секторні аналізатори), а це складне і примхливе в експлуатації обладнання.

У якийсь момент лабораторії просто захлиналися, оскільки антидопінгові служби, прагнучи протестувати якомога більше спортсменів, надсилали все більше проб.
Сьогодні в лабораторіях використовують системи, що поєднують високу ефективність хроматографічного поділу (газова і рідинна хроматографії) і мас-спектрометричного детектування. Це так звані потрійні квадрупольні мас-аналізатори (triple quads). Нові прилади з високою чутливістю і достовірністю визначають, чи є в зразку, що цікавлять нас речовини. По-перше, це дозволяє використовувати менший обсяг проби (аж до того, що її можна в кілька разів розбавити водою і безпосередньо ввести в прилад, якщо ми говоримо про рідинної хроматографії), а по-друге, збільшує кількість з'єднань, що визначаються за один аналіз . Таким чином, завдяки сучасному обладнанню методики стали простіше і універсальніше, і це помітно збільшило продуктивність антидопінгових лабораторій.

Настільний рідинної хроматограф в поєднанні з мас-спектрометром з орбітальної іонної пасткою

Паралельно розвивалися методи підготовки проби. Якщо раніше використовували в основному рідинно-рідинну екстракцію, яку практично неможливо автоматизувати, то зараз все частіше застосовують твердофазних, в тому числі варіант, при якому сорбент з потрібними властивостями наносять на поверхню магнітних мікрочастинок. Такими частинками дуже зручно маніпулювати - суспензію додають в досліджуваний зразок, і визначаються з'єднання самі адсорбуються на їх поверхні. Потім пробірку поміщають в магнітне поле, яке фіксує частки на дні, а залишки проби виливають. Після цього мікрочастинки зазвичай промивають, щоб видалити небажані компоненти, а потрібні з'єднання змивають малим об'ємом органічного розчинника - і все, зразок готовий до аналізу.

Газовий хроматограф в поєднанні з потрійним квадрупольним мас-аналізатором

Процедура підготовки проби виходить не тільки простий, але може бути легко автоматизована. Це свого роду нанотехнологія в хімічному аналізі, і зазвичай її використовують для пошуку в сечі або крові речовин пептидної природи, наприклад синтетичних аналогів інсуліну. Зараз хіміки з'ясовують, чи можна застосовувати цей спосіб ще і для вилучення низькомолекулярних сполук. На жаль, метод досить дорогий, тому його застосовують не завжди і не у всіх лабораторіях.

Часопролітної мас-спектрометр, який може поєднуватися як з рідинним, так і з газовим хроматографом

Взагалі, антидопінговий контроль орієнтований на визначення заданих з'єднань. При аналізі ви побачите тільки ті заборонені препарати, на які заздалегідь налаштований ваш хромато-мас-спектрометр, а вся інша інформація про пробі втрачається. При цьому в списку заборонених речовин у багатьох розділах є формулювання: «... та інші речовини з подібним будовою або властивостями» або взагалі «будь-які речовини, що знаходяться на стадії клінічних випробувань і не допущені до офіційного використання». Щоб мати можливість ще раз проаналізувати пробу на якісь інші речовини, не повторюючи при цьому пробопідготовку, потрібно використовувати інструментальні методи, які зберігають всю інформацію про пробі. Такі прилади є: це часопролітної мас-спектрометри або мас-спектрометри, що працюють за принципом орбітальної іонної пастки. Вони реєструють всі дані (не тільки задані) з високою роздільною здатністю, але при роботі з такими приладами є також свої складності і обмеження. Незважаючи на дорожнечу, вони вже увійшли в практику лабораторій - наприклад, у нас в Москві коштує кілька орбітальних іонних пасток (їх називають «Orbitrap»).

Як швидко робиться один аналіз? Чому іноді спортсмена дискваліфікують після того, як він вже отримав медаль?

Згідно з міжнародним стандартом, на аналіз відводиться 10 робочих днів. На великих спортивних заходах, наприклад Олімпійських іграх, цей термін складає 24 години для проб, які показали негативний результат, 48 годин - для проб, які зажадали додаткового дослідження (тобто коли результат скринінгу показав наявність забороненої речовини), і 72 години для складних видів аналізу - таких, як визначення еритропоетину або походження тестостерону методом ізотопної мас-спектрометрії.
Однак в останні роки з'явилася практика тривалого (до восьми років) зберігання проб - щоб була можливість у майбутньому, у міру появи нових заборонених препаратів і методів їх визначення, провести повторний аналіз. Так було, зокрема, з пробами Олімпіади 2008 року: більше ніж через рік після її закінчення їх проаналізували на еритропоетин нового покоління MIRCERA в антидопінгової лабораторії Лозанни, і результат для деяких спортсменів був невтішним.

Коли почали перевіряти спортсменів на використання заборонених препаратів? Скільки їх у списку Олімпіади в цьому році?

Перший список заборонених препаратів Міжнародний олімпійський комітет (МОК) опублікував в 1963 році, проте тестування почалося лише п'ять років по тому (в 1968-му) - на зимових Олімпійських іграх в Греноблі і літніх в Мехіко. Власне, історія антидопінгового контролю почалася з того моменту, коли стало технічно можливим робити подібні аналізи масово завдяки активному розвитку методів хроматографії та мас-спектрометрії.

Спочатку в список заборонених препаратів входили тільки стимулятори, наркотичні анальгетики і анаболічні стероїди. Згодом туди додалися й інші класи сполук - діуретики, бета-блокатори, бета 2 агоністи, препарати з антиестрогенної активністю, пептидні гормони, а також помітно збільшилася кількість препаратів всередині кожного класу.

Зараз в списку заборонених препаратів, який переглядають раз на рік, близько 200 сполук різної природи. Треба відзначити, що значна їх частина (наприклад, майже всі анаболічні стероїди) при попаданні в організм людини повністю метаболізується (модифікується), тому часто лабораторії визначають не самі заборонені препарати, а продукти їх перетворення в організмі. Це досить непросте завдання - для того щоб її вирішити, треба спочатку детально вивчити процес метаболізму, а потім навчитися визначати найбільш довгоживучі метаболіти. Фактично сучасний антидопінговий аналіз знаходиться на стику аналітичної хімії, біохімії і фармакології.

Підготовка антидопінгової лабораторії до Олімпійських ігор починається задовго до них. Адже до потрібного моменту вона вже повинна мати у своєму розпорядженні всіма доступними методами і методиками, в тому числі і тими, які ще не увійшли в повсякденну практику.
У світі начебто не так багато офіційно акредитованих МОК лабораторій, результати яких він визнає. Але при цьому напевно в кожній країні є й інші лабораторії, які контролюють своїх спортсменів і, безсумнівно, можуть їх попередити, виявивши якісь заборонені речовини.

Проте скандали трапляються. В чому проблема? У спортсменів або в рівні кваліфікації та ступеня оснащеності акредитованих лабораторій, які визначають менші концентрації і більший спектр речовин?

Проводити тестування спортсменів мають право тільки лабораторії, які мають акредитацію Всесвітнього антидопінгового агентства (ВАДА). Таких лабораторій зараз в світі 33, а в Росії - всього одна - ФГУП «Антидопінговий центр». Міжнародні спортивні організації категорично засуджують сприяння спортсменам у вживанні заборонених препаратів, але існують дані, що в ряді країн є лабораторії, які працюють не цілком офіційно. Зрозуміло, вони мають обмежений доступ до нових методикам тестування заборонених субстанцій. Так що цілком правильно: акредитовані лабораторії вміють більше і краще оснащені, тому обдурити їх важко.

Однак навіть ці 33 лабораторії розрізняються в оснащеності - вона сильно залежить від рівня фінансової підтримки з боку держави. Крім того, не можна не враховувати, що деякі лабораторії отримали акредитацію всього пару років назад, а інші існують вже років тридцять. Тому всі ці лабораторії формально відповідають вимогам ВАДА, проте не всі однаково гарні. Крім того, деякими методиками володіють всього одна або дві лабораторії в світі. Тому допінгові скандали все ще залишаються невід'ємною частиною сучасного спорту.

Якщо подивитися в динаміці, то кожну Олімпіаду фіксується більше або менше випадків дискваліфікації спортсменів через допінг? Яка тенденція?

Швидше за все, ми вже пройшли через максимум. У міру вдосконалення обладнання і методик хімічного аналізу від Олімпіади до Олімпіади виявляли все більше випадків порушення антидопінгового кодексу. Думаю, що апогей був досягнутий в 2004 році. Тепер ситуація змінюється на краще, так само як і свідомість спортсменів, тому організатори Олімпіади в нинішньому році сподіваються на «чисті» гри.

Ось тут повний список заборонених препаратів з назвами

Це список речовин і методів, що недозволені спортсменам. Фахівці ВАДА оновлюють його кожен рік і публікують на своєму сайті www.wada-ama.org. Він складається з трьох розділів: речовини та методи, які заборонені в спорті постійно (і під час, і поза змаганнями); речовини, заборонені тільки на змаганнях; і, нарешті, алкоголь з бета-блокаторами, які не можна вживати в деяких видах спорту під час змагань.

Окремим пунктом Всесвітнє антидопінгове агентство звертає увагу на використання біологічно активних добавок, які можуть бути поганої якості і містити заборонені речовини.

У першому розділі п'ять класів препаратів і три методи. Перший клас - анаболіки, куди входять анаболічні стероїди та інші речовини анаболічного дії. Ці речовини прискорюють всі процеси в організмі, стимулюють відновлення тканин, їх харчування і дозволяють швидко наростити м'язову масу. Про андрогенні стероїди (чоловічі та жіночі статеві гормони) все зрозуміло - про них розповідають навіть старшокласникам, в перший раз прийшли качати м'язи. А ось анаболіки нестероидной природи - набагато більш тонка субстанція. Це можуть бути блокатори і модулятори окремих рецепторів (наприклад, препарат кленбутерол, який використовують для лікування бронхіальної астми, в той же час він потужний спалювач жиру і анаболик) і нешкідливі рибоксин, метилурацил і оротат калію (кожен по-своєму і досить необразливо підвищують витривалість і регенеративні здатності організму).

Другий клас - пептидні гормони. Усередині цього класу - кілька груп, в тому числі гормони росту, інсуліни, еритропоетин та інші речовини, які підвищують м'язову масу і зменшують жирову, підвищують рівень глюкози, імунітет, витривалість і навіть знижують кількість травм.

Наступний великий клас - бета2агоністи, широкий спектр препаратів, які в медицині застосовують при хворобах серцево-судинної системи і астма. У здорових людей ці речовини на час підвищують стійкість до фізичного навантаження, оскільки розширюють бронхи і допомагають відкритися «другого дихання».

Наступний клас - гормони і метаболічні модулятори, речовини з антиестрогенної активністю. До таких належить відомий протираковий препарат тамоксифен (і йому подібні), який як золотий стандарт призначають при раку грудей у ​​жінок. У спорті його комбінують з анаболічними стероїдами, оскільки надлишок останніх перетворюється в жіночий статевий гормон естроген і може «фемінізованих» спортсменів (тамоксифен ж конкурує за рецептори з естрогеном і не дає йому діяти). З метаболічними модуляторами, а їх надзвичайно багато, - все зрозуміло: живлення клітин, прискорення метаболізму, витривалість та інше.

Плюс до перерахованого, само собою, заборонені діуретики та інші маскують агенти, що дозволяють знизити масу тіла і швидко вивести з організму зайві хімічні речовини. Також в списку ВАДА фігурують три методи: процедури, що активізують перенесення кисню в крові; хімічні і фізичні маніпуляції з кров'ю (включаючи нешкідливі внутрішньовенні вливання фізіологічного розчину); і генний допінг, в тому числі маніпуляції з нормальними і генетично модифікованими клітинами.

На змаганнях не можна використовувати речовини всіх категорій з першого розділу, а також стимулятори (включаючи краплі в ніс, що містять ефедрин), наркотики, канабіноїди (марихуану, гашиш) і глюкокортикоїди (знижують запалення, знеболюють).
Втім, спортсмени теж хворіють. Тому якщо заздалегідь подати заявку на конкретні ліки, обґрунтувавши необхідність по всім правилам науки, то можна буде отримати дозвіл на його прийом.

Санкції за порушення антидопінгових правил варіюють в діапазоні від попередження до довічної дискваліфікації. Якщо позитивний тест приходить під час змагань, то результати анулюють і спортсмена позбавляють медалей і призів. Всі результати на змаганнях, що проходили після взяття проби, також можуть бути анульовані.

За матеріалами журналу "Хімія і Життя"

Читайте на Зожніке:

Стероїди і їх вплив на організм

Допінг, стероїди і смерть спортсменів і любителів

Чому я не приймаю стероїди. Або типова історія початківця хитавиця

Навіщо чоловікам естроген

Бустери тестостерону: науковий погляд на ефективність

Розкажіть друзям:

Четвер, 24.03.2016